northern印迹杂交

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同义词 北方点墨法一般指northern印迹杂交
Northern印迹杂交(Northern blot)。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。DNA印迹技术由Southern于1975年创建,称为Southern印迹技术,RNA印迹技术正好与DNA相对应,故被称为Northern印迹杂交,与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Western blot。
中文名
northern印迹杂交
外文名
Northern blot
相似蛋白质
Western blot
p    H
高于4.0

northern印迹杂交简介

Northern印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似,只是在上样前用甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使RNA变性,而不用NaOH,因为它会水解RNA的2'-羟基基团。RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合,它同样可在高盐中进行转印,但在烘烤前与膜结合得并不牢固,所以在转印后用低盐缓冲液洗脱,否则RNA会被洗脱。在胶中不能加EB,因为它会影响RNA与硝酸纤维素膜的结合。为测定片段大小,可在同一块胶上加分子量标记物一同电泳,之后将标记物切下、上色、照相,样品胶则进行Northern转印。标记物胶上色的方法是在暗室中将其浸在含5μg/ml EB的0.1mol/L醋酸铵中10min,光在水中就可脱色,在紫外光下用一次成像相机拍照时,上色的RNA胶要尽可能少接触紫外光,若接触太多或在白炽灯下暴露过久,会使RNA信号降低。
琼脂糖凝胶中分离功能完整的mRNA时,甲基氢氧化银是一种强力、可逆变性剂,但是有毒,因而许多人喜用甲醛作为变性剂。所有操作均应避免RNase的污染。
原理:
整合到植物染色体上的外源基因如果能正常表达,则转化植株细胞内有其转录产物——特异mRNA的生成。将提取的植物总RNA或mRNA用变性凝胶电泳分离,则不同的RNA分子将按分子质量大小依次排布在凝胶上;将他们原位转移到固定膜上;在适宜的离子强度及温度条件下,用探针与膜杂交;然后通过探针的标记性质检测出杂交体。若经杂交,样品无杂交带出现,表明外源基因已经整合到植物细胞染色体上,但在该取材部位及生理状态下该基因并未有效表达。

northern印迹杂交RNA甲醛凝胶电泳和吸印方法

northern印迹杂交<1>试剂

10×MSE缓冲液:0.2mol/L吗啉代丙烷磺酸(MOPS),pH7.0,50mmol/L醋酸钠,1mmol/LEDTApH8.0。
5×载样缓冲液:50%甘油,1mmol/LEDTA,0.4%溴酚蓝
甲醛:用水配成37%浓度(12.3mol/L),应在通风柜中操作,pH高于4.0。
20×SSC;
去离子甲酰胺
50mmol/LNaOH(含10 mmol/L NaCl);
0.1mol/LTris,pH7.5。

northern印迹杂交<2>步骤

[1]40ml水中加7g琼脂糖,煮沸溶解,冷却到60℃,加7 ml 10×MSE缓冲液,11.5ml甲醛,加水定容至70ml,混匀后倒入盛胶槽。
[2]等胶凝固后,去掉梳子和胶布,将盛胶槽放入1×MSE缓冲液的电泳槽。
[3]使RNA变性(最多20μg),RNA4.5ml,10×MSE缓冲液20ml,甲醛3.5ml,去离子甲酰胺10ml。
[4]55℃加热15min,冰浴冷却。
[5]加2 ml 5×载样缓冲液。
[6]上样、同时加RNA标记物同位素(32P)dCTP)。
[7]60伏电泳过夜。
[8]取出凝胶,水中浸泡2次,每次5min。
[9]室温下将胶浸到50mmol/LNaOH和10mmol/LNaCl中45min,水解高分子RNA,以增强转印。
[10]室温下将胶浸到0.1mmol/L TrisHCl(pH7.5)中45min,使胶中和。
[11]20×SSC洗胶1h。
[12]20×SSC中过夜转印到硝酸纤维素膜上。
[13]取出硝酸纤维素膜,80℃真空烘烤2h。
<3>注意事项
[1]严格遵守试验规则,务必准确。
[2]由于好多药品是有毒的,对人体有害,请注意自身安全,做好防护。
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